Sztuki PI to klucz do pokonania BVD.
Szczepienie bez usunięcia zwierząt PI jest chyba najbardziej powszechnym błędem z jakim można się spotkać w terenie. Hodowcy są często bardziej skłonni by wydać pieniądze na szczepienie niż na badanie zwierząt w kierunku, którego nie rozumieją. Badania laboratoryjne w naszym kraju są w naszej ocenie wciąż za rzadko wykorzystywane w praktyce lekarsko weterynaryjnej. Nie da się niestety skutecznie zwalczyć BVD, jeżeli nie wyszukamy a następnie nie usuniemy zwierzęcia trwale zakażonego.
Dwa warianty programu kontroli.
W zależności od wyników jakie uzyskamy badając przeciwciała w mleku oraz w zależności co pokaże Spot Test decydujemy, czy będziemy wyszukiwać sztuki PI (wyszukiwanie antygenu u sztuki wiremicznej, która jest zakażona trwale lub przejściowo), czy nie. Jeśli mamy dodatni wynik badania ELISA surowicy cieląt (>60% próbek z wynikiem dodatnim) i mleka zbiornikowego (S/P>0,75), wtedy rozpoczynamy wyszukiwanie zwierząt PI. Jeśli mamy dodatni wynik badania ELISA surowicy cieląt i ujemny wynik badania mleka zbiornikowego – również rozpoczynamy wyszukiwanie zwierząt PI. Jeśli mamy ujemny wynik badania ELISA surowicy cieląt i dodatni wynik badania ELISA mleka zbiornikowego – powtarzamy Spot Test za 3-6 miesięcy.
Wyszukiwanie zwierząt PI można przeprowadzić na wiele różnych sposobów. Przedstawimy dwa z nich, które naszym zdaniem najbardziej zasługują na uwagę lekarzy praktyków i hodowców, ponieważ są optymalne, czyli skuteczne, proste i tanie. Dla ułatwienia nazwijmy je: “WOLNY” i “SZYBKI”. Różnica polega na tym, jak szybko hodowca i lekarz będą mogli poznać status zwierząt w stadzie. Decyzja o tym, który program wdrożyć zależy nie tylko od wyniku Spot Testu, lecz od kilku dodatkowych czynników, takich jak nastawienie właściciela stada i na przykład jego sytuacja finansowa.
Można zaryzykować uogólnienie, że program „wolny” doradzamy w stadach bydła mięsnego i w tych stadach bydła mlecznego, w których hodowca nie jest skłonny wydać w krótkim czasie pieniędzy na badania. Program „szybki” doradzamy w stadach, w których wynik Spot Testu bez wątpliwości wskazuje na obecność sztuk PI, ale też w stadach wątpliwych a nawet ujemnych, gdy właściciel chce, na przykład z powodów komercyjnych, jak najszybciej mieć pewność, że stado jest wolne od wirusa BVD.
I. Program “WOLNY”
Badanie próbek tkanki skóry.
Program „wolny” polega na badaniu nowonarodzonych cieląt z użyciem odpowiednich próbników połączonych z kolczykami, służących do pobierania próbek tkanki z ucha. Próbki wycinków z ucha minimum 2-3 mm można pobrać przy użyciu zestawów do pobierania oferowanych przez firmy Afflex, Can Agri czy też Noack. Zaletą systemów do pobierania wycinków z ucha jest pełna identyfikowalność zwierząt oraz zabezpieczenie próbki w probówce dołączonej do zestawu. Do tego celu mogą być używane próbniki z „urzędowymi” żółtymi kolczykami z numerem zwierzęcia lub inne kolczyki, o innym kształcie i kolorze z innym oznaczeniem (TST – Tissue Sampling Tag). Można też użyć próbniki bez kolczyka (TSU -Tissue Sampling Unit) te same lub podobne do tych, które używa się do pobierania próbek do badań genomicznych. Dlaczego pobieramy próbki tkanki z ucha a nie surowicę krwi? Otóż dlatego, że do ukończenia mniej więcej trzech miesięcy życia przeciwciała matczyne zawarte w surowicy krwi cieląt mogą zafałszować wynik antygen ELISY, a do 2-3 tygodnia życia nawet PCRu. Natomiast próbki skóry można badać w pierwszych dniach życia, bezpośrednio po podaniu nawet dużych ilości siary. Wirus BVD umiejscowiony jest w warstwie rogowej i kolczystej naskórka oraz w cieśni i lejku mieszka włosowego.
Badanie nowonarodzonych cieląt.
Badanie nowonarodzonych cieląt pozwala na bezpośrednie i pośrednie rozpoznanie zwierząt PI i wraz z upływem czasu na systematyczne poznawanie statusu coraz większej części stada. Rozpoznaje się status każdego nowonarodzonego cielęcia („PI” lub „nie PI”) jak najszybciej po urodzeniu. Bada się wszystkie cielęta: żywe i martwo urodzone jałóweczki i byczki, a także poronione płody. Lekarz może podjąć decyzję o pobieraniu próbek od martwo urodzonych cieląt i poronionych płodów alternatywną metodą biopsji ucha. Jedynym wymaganiem jest, aby metoda pozwalała laboratorium na zbadanie tak pobranej próbki. Można również w celu zbadania pobrać płyn z poronionego płodu. Wynik ”nie PI” jest też używany do wyznaczenia statusu matki cielęcia, która również jest wtedy „nie PI”. Cielę nie zakażone trwale nie może pochodzić od matki trwale zakażonej, ponieważ matka PI zawsze rodzi cielęta PI. Tak więc ujemny wynik cielęcia pośrednio wyklucza też jego matkę. Matki cieląt PI muszą być natomiast zbadane, aby potwierdzić lub wykluczyć ich trwałe nosicielstwo. Jedynie niewielka część cieląt PI pochodzi od matek trwale zakażonych, większość jest rodzona przez matki czasowo zakażone wirusem w czasie pierwszego trymestru ciąży.
Zwierzęta z dodatnim lub wątpliwym wynikiem pierwszego badania należy odizolować od reszty stada, ponownie pobrać próbkę tkanki po 3-4 tygodniach i zbadać ją na obecność antygenu. Drugi wynik dodatni świadczy o trwałym zakażeniu zwierzęcia. Ujemny wynik drugiego badania wykazuje, że zwierzę było zakażone czasowo (Transient Infection – TI). Wykrycie zwierzęcia czasowo zakażonego dostarcza dowodu na aktualne krążenie wirusa w stadzie. Ponieważ najbardziej prawdopodobnym źródłem zakażenia wirusem jest kontakt z osobnikiem PI, należy podjąć wszelkie niezbędne kroki w celu jak najszybszego wykrycia go i usunięcia ze stada.
Po trzech latach prowadzenia programu w stadzie zostanie w nim bardzo niewiele lub wcale nie będzie zwierząt o nieznanym statusie i w tym czasie prawie wszystkie lub nawet wszystkie PI będą już zidentyfikowane. Należy wtedy przejrzeć dokumentację i zbadać pozostałe dotychczas nie zbadane i nie rozpoznane pośrednio zwierzęta.
Antygen ELISA i RT-PCR.
Teraz trochę informacji o badaniach laboratoryjnych i pobieraniu próbek. Tkankę ucha pobraną za pomocą próbników można badać w kierunku obecności antygenu BVD dwiema metodami: zbiorowo RT-PCRem i pojedynczo antygen ELISĄ. Testy ELISA umożliwiają wykrywanie antygenu wirusa BVD w surowicy oraz wycinkach chrząstki ucha u cieląt.Testy te mają zastosowanie przy wyszukiwaniu sztuk trwale zakażonych w stadzie lub potwierdzaniu podejrzenia sztuki PI w stadzie u indywidualnych zwierząt. Skuteczność komercyjnych testów diagnostycznych (głównie ELISA) w rozpoznawaniu antygenu wirusa BVD oceniana jest w zakresie od dobrej do znakomitej Oprócz metod serologicznych przy programach uwalniania stad od zwierząt trwale zakażonych stosowane są metody biologii molekularnej PCR lub PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR), których zaletą jest wysoka czułość umożliwiająca wykrycie nawet niewielkiej ilości materiału genetycznego, a co za tym idzie pulowanie próbek, czyli badanie próbek zbiorczych pobranych od określonej grupy zwierząt. W wypadku RT- PCRu laboratorium puluje próbki w zależności od oczekiwanej czułości, zwykle po 20-25 sztuk i przeprowadza badanie puli. W wypadku uzyskania wyniku dodatniego puli próbek tkanki z uszu pobranych przy użyciu próbnika trzeba niestety ponownie pobrać próbki tkanki od wszystkich zwierząt, które znalazły się w puli. Próbka tkanki może być użyta tylko raz, ponieważ cała ulega zniszczeniu w czasie badania. Próbki z drugiego pobierania bada się już pojedynczo metodą antygen ELISA. Można skalibrować RT-PCR w celu różnicowania czasowo od trwale zakażonych zwierząt, lecz o wiele prościej jest ponownie zbadać kandydata na PI metodą antygen ELISA, ponieważ metoda ta również reaguje na odpowiedź przeciwciał czasowo zakażonych zwierząt blokującą wykrycie antygenu wirusa lub replikację. Na pierwszy rzut oka wydaje się, że pulowanie do badania RT-PCR znacznie obniża koszt całego przedsięwzięcia, ale przy bliższym przyjrzeniu się widzimy, że może być potrzebne więcej wizyt, więcej próbników, więcej poświęconego czasu. Weźmy też pod uwagę, że w małych gospodarstwach potrzeba będzie sporo czasu, żeby uzbierać 20-25 próbek do badania RT-PCR, a potencjalny PI w tym czasie stoi i sieje. Dlatego też w wielu sytuacjach łatwiej, szybciej i taniej jest badać próbki metodą antygen ELISA. Metoda ta w tym zastosowaniu jest sprawdzona, wystarczająco czuła, podlega akredytacji i znalazła zastosowanie w programach uwalniania od BVD w Europie, na przykład w Niemczech i Belgii. W wypadku dodatniego pierwszego wyniku indywidualnego badania metodą antygen ELISA należy ponownie pobrać próbkę po 3-4 tygodniach i zbadać ją również tą samą metodą. To tylko dwa pobrania, dwa badania i można je wykonywać natychmiast po urodzeniu cielęcia, nie czekając aż uzbieramy pulę do RT-PCR. Jest to ważne, bo im szybciej wykryjemy i usuniemy cielę PI, tym lepiej. W żadnym wypadku nie powinno to nastąpić później niż dwa, maksymalnie trzy tygodnie po urodzeniu. Jeżeli jakieś ciele nie zostanie z jakiegoś powodu zbadane i ubędzie ze stada lub martwy płód zostanie zutylizowany bez badania, należy dla dobra programu uznać je za trwale zakażone.
Jeśli w czasie badań w programie „wolnym” wykryje się zwierzęta dodatnie, co świadczy o aktualnym krążeniu wirusa w stadzie radzimy, jeśli to możliwe, przejście do programu „szybkiego”, aby jak najszybciej zatrzymać to krążenie, związany z nim łańcuch zakażeń i w konsekwencji straty ekonomiczne.
Informacje z praktyki terenowej
Zaletą pobierania krwi jest stosunkowo niski koszt pobrania materiału oraz fakt, że z jednej próbki możemy wykonać dwa badania. Ma to znaczenie, jeżeli pula okaże się dodatnia i będzie trzeba ustalać, które konkretne zwierzę jest PI. Wadą jest czas jaki musimy czekać na spadek mian przeciwciał matczynych (3 miesiące) oraz to, że nie wszystkie zwierzęta urodzone na tej fermie zostaną zbadane. Byczki zwykle są sprzedawane w młodszym wieku. Zaletą pobrania wycinków z ucha jest szybkość uzyskania próbek (od razu po urodzeniu – nic nas nie limituje). Ważne jest również to, że materiał pobieramy od całego potomstwa, a nie tylko od części żeńskiej jak ma to miejsce podczas pobierania krwi. Niewątpliwą wadą jest koszt takiej próbki oraz fakt, że jest to próbka ulegająca zniszczeniu. Oznacza to, że nie możemy z jednej próbki wykonać kilku badań. Od zwierząt z puli dodatniej musimy jeszcze raz pobrać materiał.
Opracowano na postawie serii artykułów opracowanych przez: lek.wet. Marka Branickiego (MSD AH), lek.wet. Sławomira Koźmińskiego (BVS) oraz lek.wet. Jarosława Szubstarskiego (Laboratorium Diagnostyczne).